規範環境下(xià)色譜積分(fēn)的(de£€♣‌)合理(lǐ)合規性控制(zhì)

為(wèi)确保對(duì)色譜峰進行(xíng)正确的(de)測量（或積分←✘β≈(fēn)），需要(yào)分(fēn)析人(rén←Ω≥)員(yuán)對(duì)積分(fēn)結果進行(xíng)準确性和(hé)β 一(yī)緻性判斷。在大(dà)多(duō)數(shù)情況下¶©(xià)，人(rén)為(wèi)參與的(de)過程往λδ<→往會(huì)導緻判斷結果受到(dào)非客觀标準的(de)影(yǐng)響。÷✘←δ所以色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性尤φ♦↑為(wèi)重要(yào)，這(zhè)σ₹✘也(yě)是(shì)監管機(jī)構的(de)審查重點，這(zσΩαhè)篇文(wén)章(zhāng)我們将簡要(yào)討♥±©¶(tǎo)論如(rú)何對(duì)色譜積分(fēn)進行(xíng)合理 §&∏(lǐ)合規性控制(zhì)。

1 簡介

高(gāo)效液相(xiàng)色譜（HPLC）和(hé)氣相(x±&® iàng)色譜（GC）是(shì)現(xiàn)代分(fγ∞ēn)析實驗室中最常用(yòng)的(de)技(jì)術(sh¥β≤ù)。這(zhè)兩種技(jì)術(shù)的(☆¶☆de)專屬性、靈敏度和(hé)靈活性使其适用(yòng)于廣≠÷≤∏泛的(de)樣品基質中絕大(dà)多(duō)數(shù)→Ω↑被分(fēn)析物(wù)的(de)測定。這(zhè)兩'↕<種技(jì)術(shù)的(de)原始輸出都(dβ↔​ōu)是(shì)信号強度對(duì)比時(sh±✔í)間(jiān)的(de)曲線圖，通(tōng)常稱為§₹♥β(wèi)色譜圖。色譜圖中的(de)各個(€ σgè)峰分(fēn)别對(duì)應于樣品中的(de)≠≤βπ各個(gè)成分(fēn)，而峰面積通(tōng)常正比于樣品中★§​​相(xiàng)應成分(fēn)的(de<" )濃度。

要(yào)定量樣品中的(de)被分(fēn)析物(wù)濃度，就↓"(jiù)需要(yào)對(duì)色譜圖進行(xíng)積分δ€(fēn)以測量峰的(de)面積。現(xiàn)代§∑&高(gāo)效液相(xiàng)色譜法和✔↓ ✔(hé)氣相(xiàng)色譜儀配備的(de)電×→€≤(diàn)腦(nǎo)色譜數(shù)據采集和(hé)處理(lǐ)∞®系統，都(dōu)具備自(zì)動化(huà)積分(fēn)的(de)功能↓✔☆↓(néng)，分(fēn)析人(rén)員(yuán)需要(yào)做(zu$£ò)的(de)主要(yào)是(shì)設定适當的(de₩∞♥γ)積分(fēn)參數(shù)（例如(rú)：斜率靈 ₽敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值λ &∞，峰高(gāo)阈值，撇去(qù)率等），軟件(€≥✔✘jiàn)将依據這(zhè)些(xiē)參數(s£αhù)來(lái)對(duì)各個(gè)色譜峰進行(xí'₹★αng)确認和(hé)積分(fēn)。

2 監管要(yào)求

由于分(fēn)析人(rén)員(yuán)可(kě)以根∞✘↓據自(zì)己的(de)主觀判斷人(rén)為(wèi)地(d←♥ì)設定積分(fēn)參數(shù)，無論在"§÷Ω常規審查或藥品生(shēng)産上(shàng)市(s‍φεhì)授權評估過程中，對(duì)色譜峰正确和(hé)精确的∞  (de)積分(fēn)及其過程都(dōu)是(sh↑"ì)重點審核內(nèi)容。

從(cóng)美(měi)國(guó)FDA對(duì)藥企≠☆γ發布的(de)警告信中，可(kě)以看(kàn)到(dào)關¥<δ¥于色譜積分(fēn)的(de)一(yī)些(xiē' ‌∑)更加具體(tǐ)化(huà)的(de)α♣↑✔要(yào)求：

• 不(bù)允許采用(yòng)手動積分(fēn)。

• 需要(yào)開(kāi)啓色譜軟件(jiàn)的(de)審計(jì)跟蹤功£↕₹€能(néng)，并将包含積分(fēn)參數(shù)的(de§→≈)分(fēn)析方法和(hé)原始數(shù)據一(yī)同保β‌存，以确保方法的(de)積分(fēn)參數(shù)修 '改曆史可(kě)追溯。

• “更改積分(fēn)參數(shù)，以得(de)≠♠★到(dào)好(hǎo)的(de)積分(fēn)結果”是(shì)π£不(bù)可(kě)接受的(de)。在審查過程中，沒有(yǒu)合理(lǐ∏★∑σ)解釋的(de)多(duō)次重新積分(fēn)被認為(wèi)是↓↑±(shì)企圖人(rén)為(wèi)操縱峰面積以獲得(de)合格的(dε×δβe)結果。

• 方法一(yī)旦經過驗證且被用(yòng)于藥品的($✔₹de)常規QC放(fàng)行(xíng)，對(duì)後續每個(gè™‌)色譜數(shù)據的(de)積分(fēn)都(dōuλ↕©)需要(yào)使用(yòng)該方法以确保一(yī)緻性。FDA當‍β前的(de)期望實際上(shàng)是(shì)傾向于将色譜方法“鎖定”以保↓★→γ證始終使用(yòng)同樣的(de)積分(fēn)參數(↓→≈shù)。

綜合來(lái)講，色譜峰的(de)積分•¥(fēn)、積分(fēn)參數(shù)的(de)設定和(hé)驗證、積分(>&fēn)參數(shù)的(de)修改和(hé)再驗證等都(dε×≤‍ōu)要(yào)遵循科(kē)學合理(lǐ)的♣€'∑(de)過程，并通(tōng)過标準操作(zuò)規程（Sσ>α₽OP）或類似的(de)文(wén)件(jiàn)進行(xíng)控制(zhì±λ™)。

3 控制(zhì)色譜積分(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性£ ←

那(nà)麽，要(yào)怎樣控制(zhì)色譜積分÷™(fēn)的(de)合理(lǐ)合規性呢(ne)？™★我們分(fēn)以下(xià)幾個(gè)小(x€≤∑iǎo)節來(lái)探討(tǎo)。

3.1 通(tōng)用(yòng)積分(fēn)過♠£‌程及參數(shù)

為(wèi)了(le)對(duì)積分(fē≈¥÷n)參數(shù)進行(xíng)設定，有(yǒu)必要(yà↓ σ'o)了(le)解色譜數(shù)據處理(lǐ)程序是(shì)如(rú)何進 →行(xíng)積分(fēn)的(de)。這(± ≈zhè)裡(lǐ)将嘗試討(tǎo)論一(yī)個(gè)通(tō≈<ng)用(yòng)的(de)過程，不(bù)同的(de)色譜Ω™數(shù)據處理(lǐ)系統可(kě)能(néng)在細節上(shà↕''Ωng)有(yǒu)所不(bù)同。

色譜積分(fēn)過程包括下(xià)列事(shì)件(jiàn)™↔α≈：

  • 确定初始基線

首先取第一(yī)數(shù)據點作(zuò)為(wè±≈i)一(yī)個(gè)暫定基線點。然後積分(fēn ♠)器(qì)取一(yī)定數(shù)據點的(de)平均值重λ↔新定義初始基線點。用(yòng)作(zu≠δò)取平均值的(de)數(shù)據點數(shù)是(←Ω​§shì)由峰寬函數(shù)決定的(de¶λ♠×)。在确立了(le)的(de)新的(de)基線點前，第一(≤& ≠yī)數(shù)據點被取作(zuò)初始基¶∑≥©線點。

  • 連續追蹤和(hé)更新基線

随著(zhe)積分(fēn)器(qì)不(bù)斷錄入新的(de)數(shù•÷)據點，基線點需要(yào)向後推移并更新。被接納為(wèi₹​)基準點，一(yī)個(gè)數(shù)據點必須符合以下(xià)條件(ji→₩ $àn)：

  • 它必須在所指定的(de)由斜率阈值決定的(de)基線阈值內(γ÷nèi)

  • 基線的(de)曲率必須低(dī)于由斜率阈值确定的(de)阈值

  • 累積總和(hé)不(bù)能(néng)超過指定的(de)面ε∏積阈值

基線以由峰寬值決定的(de)速率不(bù)斷重​ ♣置，直到(dào)檢測出色譜峰。

  • 色譜峰開(kāi)始時(shí)間(jiān)的(de)識别和(hé)确認

當新錄入的(de)數(shù)據點超出基線阈值，并且 ©≈基線曲率超過由斜率靈敏度函數(shù)确定的(de)設定值，→©即辨别出一(yī)個(gè)潛在的(de)色譜峰。如(rú)果接下(xià∑ &)來(lái)的(de)數(shù)據點保持上(shàng)升，并滿足下(xi∏±‍≈à)列條件(jiàn)，積分(fēn)器(qì)即識别出一(yī)個≠±λ±(gè)潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(shí)間(jiān)。

  • 斜率和(hé)曲率超過由基線阈值确定的(de)限值

  • 連續的(de)數(shù)據點之間(jiān)的(<£de)差值超過噪聲阈值

潛在的(de)色譜峰開(kāi)始時(shí)間(jiān)被确認£ ™的(de)條件(jiàn)需要(yào)符合下(xià)列标準：

  • 斜率繼續超過由基線阈值确定的(de)限制(zhì)

  • 累計(jì)面積超出峰面積阈值

  • 曲率變為(wèi)負值形成前拐點

  • 色譜峰頂點的(de)确認

峰頂點的(de)确認需要(yào)滿足下(xià)列條件≥π"(jiàn)：

  • 斜率通(tōng)過零點并變為(wèi)負值

  • 曲率變為(wèi)正值

  • 後續數(shù)據點的(de)值降低(dī)，且該數(shù)據點與​☆∏•後續3個(gè)數(shù)據點的(de)峰面積差累計(jì)π‌£ 超過2/3的(de)峰面積阈值。

  • 色譜峰終點的(de)識别和(hé)确認

色譜峰潛在終點的(de)識别條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率回落到(dào)由基線阈值确定的(εσde)限值內(nèi)

  • 兩個(gè)連續的(de)數(shù)據點之間(jiān)的(de)差值小(xδ±♣iǎo)于5倍噪聲阈值

  • 色譜峰終點的(de)确認條件(jiàn)：

  • 斜率和(hé)曲率保持在基線阈值确定的(d±♥e)限值內(nèi)

  • 在方法建立過程中，依據不(bù)同參數(shù)對(duì)色÷δ譜積分(fēn)事(shì)件(jiàn)的(de)作<₽(zuò)用(yòng)進行(xíng)各參數(sh ¥Ωù)（斜率靈敏度，噪聲阈值，峰寬阈值，峰面積的(de)阈值，峰高≥ "σ(gāo)阈值等）的(de)設定。

3.2 未完全分(fēn)離(lí)色譜峰

對(duì)于色譜峰的(de)最準确的(de)積分(fēn)要(yào)←β♦∞求所有(yǒu)的(de)峰完全分(fēn)離(lí)。如(rú)<β有(yǒu)某些(xiē)需要(yào)精确定量測定的(de)峰沒有(y<γǒu)完全分(fēn)離(lí)，首先需要(yào)優化(huà)色譜分(f'‍ēn)離(lí)條件(jiàn)。在經過大(dà)量努力後還(h᧱λαi)是(shì)不(bù)能(néng)獲得(de)充分(fēn)分(§♠≥♠fēn)離(lí)的(de)情況下(xià)，可(kě​§)以考慮通(tōng)過合理(lǐ)的(de)積分(fēn)獲取未分✔<£(fēn)離(lí)組分(fēn)相(xiàng)對(duì)的(​$☆de)準确峰面積。

如(rú)果定量數(shù)據必須從(c✘σ ¶óng)未分(fēn)離(lí)峰獲得(de)，需要(yào)制(zh₹ ì)定明(míng)确的(de)規定，以便确定未分(fē✘♠>₽n)離(lí)峰應該如(rú)何積分(fēn)。這(zhè)樣的(de'£↕)規定應該包含在什(shén)麽情況下(x&≈×>ià)可(kě)以使用(yòng)什(shén)麽功能(néng)對(duì∏✔)未分(fēn)離(lí)色譜峰進行(xín‌ε®​g)積分(fēn)，這(zhè)些(xiē)ε∑功能(néng)包括：

  • 切線撇去(qù)

  • 指數(shù)撇去(qù)

  • 指數(shù)曲線拟合

  • 直線撇去(qù)

  • 前伸峰撇去(qù)

  • 拖尾峰撇去(qù)

  • 峰谷比

  • 谷高(gāo)比

  • 谷垂直切分(fēn)

3.3 積分(fēn)效果的(de)基本要(§π¥‌yào)求

進行(xíng)合理(lǐ)合規的(de)積分(fēn)需要(♠¶yào)明(míng)确怎樣才算(suàn)是(shì)适當和(‌πhé)準确的(de)積分(fēn)。筆(bǐ)者認為(wèi)原則♥↔性的(de)标準應該是(shì)“不(b♠∏δù)多(duō)不(bù)少(shǎo)✘$”地(dì)積分(fēn)。

為(wèi)使同一(yī)實驗室內(nèi)不(bù)同分(fēn)析人₹λ(rén)員(yuán)有(yǒu)一(yī)個(gè)統一(↕Ω'yī)的(de)标準，建議(yì)在書(shū)面文(wén)¥₩檔中用(yòng)圖表來(lái)說(shuō)明(míng)什(shén)©☆£麽是(shì)可(kě)接受的(de)色譜峰，什(shén)麽是(shì)不<λ♦ (bù)可(kě)接受的(de)色譜峰。如(rú)•$圖2，其中峰A表示可(kě)接受的(de)積分(fēn™₽λ♦)峰；而峰B是(shì)不(bù)可(kě)接受的(dλΩγ↓e)峰積分(fēn)，因為(wèi)峰的(d©₽↓αe)拖尾部分(fēn)未被完全積入；&nb ↓sp;峰C也(yě)是(shì)不(bù)♣∑∑<可(kě)接受的(de)，因為(wèi)将可≤ (kě)能(néng)是(shì)基線漂移的(de)區(q÷‌±ū)域積進去(qù)了(le)。

3.4 積分(fēn)參數(shù)的(de)設定和(hé)驗∑∏$證

在做(zuò)主成分(fēn)測定時(shí)，數(shù)據處→ 理(lǐ)方法的(de)控制(zhì)相(xiàng)對(duì)∞∏ 容易。但(dàn)是(shì)當涉及到(dàoγα)有(yǒu)關物(wù)質測定時(shí)，數( ±€shù)據處理(lǐ)方法的(de)開(kāi)發和(hé)控制(¥≠•zhì)有(yǒu)時(shí)候是(shì)非常具有(yǒu)挑戰性λ♥>的(de)。建議(yì)在方法學的(de)準×→€确度和(hé)精密度驗證部分(fēn)，↔♠專門(mén)考察改變積分(fēn)參數(shù)對(∞→☆duì)最終結果的(de)影(yǐng) γ響。可(kě)以使用(yòng)在回收率實驗中獲得(de)的(d§£e)原始數(shù)據，對(duì)下(xià)面的(de)主要(yào)積分☆α(fēn)參數(shù)進行(xíng)系統化(huà)地(dì)測®✔試（不(bù)同的(de)數(shù)據處理(lǐ)軟件(jiàn)可(←≈×∏kě)能(néng)有(yǒu)不(bù)同的(de)參數(shù)₩↕"）：

• 斜率靈敏度

• 峰寬阈值

• 峰高(gāo)阈值

• 面積阈值

• 噪聲阈值

記錄并評估這(zhè)些(xiē)參數(shù)的(deΩ≤→)改變對(duì)回收率計(jì)算(suàn★ε↕ )結果的(de)影(yǐng)響，并在滿足回收率标準（通(tōng‍'∑)用(yòng)标準為(wèi)98.0~÷♣™102.0%）的(de)參數(shù)組合中選擇居中的(d←γ€e)參數(shù)組合，以便獲得(de)更好(hǎo)的(de)方法耐用(y¥©òng)性。後續出現(xiàn)分(fēn)析結果異常（如(rú)出現(xiσβàn)新的(de)未知(zhī)雜(zá)質）需要(​£ yào)重新設定積分(fēn)參數(shù)時(shí)，這(zh∏↕★≤è)些(xiē)對(duì)參數(shù)改變的(de)研究數(shù)₽♦  據，也(yě)可(kě)以為(wèi)參數(shù)的(de§✔♠)可(kě)修改範圍提供依據。

3.5 特殊情況下(xià)積分(fēn)參數(‌‍δ∑shù)的(de)重新設定和(hé)驗證

分(fēn)析人(rén)員(yuán)有(yǒu)時(shí)候會(Ω☆♣₽huì)遇到(dào)一(yī)些(xiē)特殊情況€ε•≥。比如(rú)，一(yī)個(gè)通(tōng)過驗證的(de)方法©☆∑，在常規分(fēn)析時(shí)完全沒有(yǒu)問(wè™✘n)題，但(dàn)在穩定性測試期間(jiān)，有(y↔φ₹∏ǒu)時(shí)候後會(huì)有(y☆₽&ǒu)新的(de)色譜峰、峰型改變、共洗§∏脫峰等異常情況，這(zhè)種情況下(xià)往往原來(lái)的(de)分(×∑★≠fēn)析方法不(bù)再适用(yòng)。

如(rú)果是(shì)已上(shàng)市(shì)藥品出現(xià€¶∞¶n)了(le)上(shàng)述異常情況，表示這(zhè)些(xiē)産λ↔±λ品可(kě)能(néng)不(bù)符合規範，并應啓•'動實驗室和(hé)生(shēng)産調查，以表征雜(zá)質，‌™₽£并确定其來(lái)源。這(zhè)種情況一(λ£≈yī)旦經過确認，企業(yè)需要(yào)從(cóng)市(shì)場(ch>≤ ₩ǎng)上(shàng)召回産品，因為(wèi)α≤ >一(yī)個(gè)産品降解特性的(de)鑒定是(shì)銷售許可(kě →¥∏)的(de)先決條件(jiàn)。

在另一(yī)方面，如(rú)果異常情況出現(xiàn)在産品開(kāiεε✔)發的(de)早期階段，同樣需要(yào)表征雜(zá)質和(hé)£λ₩确定其來(lái)源。這(zhè)時(shí)候分(fēn)析人(ré₹•↓✔n)員(yuán)可(kě)能(néng)需要(yào)修改數(shù)據處理§ ₹™(lǐ)方法或者整個(gè)分(fēn)析方法∞£ε并重新驗證。這(zhè)種情況在藥物(wù)研發的(de) γφ早期階段經常發生(shēng)，可(kě)以說(shuō)分(fēn)析方法∑® 驗證應被視(shì)為(wèi)一(yī)個(gè)過程，而非一(yī)次性的λ←(de)工(gōng)作(zuò)。

4 結論意見(jiàn)

色譜峰的(de)積分(fēn)是(shì)在現(xiàn)代分αφ✔ (fēn)析實驗室中最經常執行(xíng)的(de)活動之一(yī)。為(✘ wèi)了(le)獲得(de)一(yī)緻的(de)結↔ ‌ 果，每次分(fēn)析數(shù)據的(de)積分(fēn¶♦∑↔)都(dōu)需要(yào)使用(yòng)相(xiàng)同的(de)方式。π→≥↓正是(shì)出于這(zhè)個(gè)£↑¥原因，我們建議(yì)實驗室建立适當的(de)規範和(hé)标準操作∞Ω≥(zuò)程序，為(wèi)準确和(hé)科(kē)學的(de)積分(fēn≠<)提供明(míng)确的(de)依據。

此外(wài)，應該建立明(míng)确的(de)程序，規範方法δ✘★開(kāi)發和(hé)驗證階段的(de)積分(fēn)參數(shù)選擇和↕σ×"(hé)驗證。而經核準的(de)書(shū)面方法應該包括合适的(de)色♣φ>​譜積分(fēn)參數(shù)，并指定允許分(fēn)析人(rén¶¥)員(yuán)在必要(yào)的(de)異常情況下(xià)作(zuò≠♥←γ)出适當調整的(de)範圍。一(yī)個(gè)方法一"✘≈∞(yī)旦經過驗證且被使用(yòng)，之後對(duì)每個(gè)色譜‌>數(shù)據的(de)積分(fēn)都(dōu)需要(yào)用(γ‍Ωyòng)這(zhè)個(gè)方法以确保使用(yòng)相‌Ω(xiàng)同的(de)參數(shù)。而出現(xiàn)異常情<≠↓況對(duì)方法做(zuò)出調整後，需要(yào)重新驗證并✔≈對(duì)異常事(shì)件(jiàn)根源進行(xíng)調查和(‍☆‌•hé)合理(lǐ)的(de)解釋。